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*的液相色譜柱知識分享和選擇技巧分享

閱讀：2506 發(fā)布時間：2021-5-19

　現(xiàn)代高效液相色譜分析中，色譜柱的選擇直接影響了分離效果的好壞，選擇合適的色譜柱可以縮短方法開發(fā)所需的時間，并且使方法更具穩(wěn)定性。但是現(xiàn)在市場上色譜柱種類繁多，不同類型的色譜柱分離對象不同，因此，要做合適的選擇，必須對此有一定的認識和了解。

　　色譜柱參數(shù)

　　物理性質(zhì)：

　　柱長，內(nèi)徑，如250*4.6mm。一般柱長在2—250mm，柱越長，分離度越高，但柱壓更高，分離所需時間更長；但分離度與理論塔板數(shù)的平方根成正比，所以一昧增加柱長并不是*的分離手段，一般情況下，150mm、5um的填料可以提供足夠的塔板數(shù)。

　　粒徑，影響色譜分離度。粒徑越小，分離越快，柱效越高，但柱壓力越高，柱容易被污染，導(dǎo)致柱壽命降低。常見分析柱通常使用5um填料，復(fù)雜的多組分樣品分離一般使用3.5um粒徑，更大內(nèi)徑的制備色譜柱通常使用更大的粒徑。如果固定相選擇是正確，但是分離度不夠，那么選用更小的粒度的填料是很有用的。3.5um填料填充柱的柱效比相同條件下的5um填料的柱效提高近30%；然而，3.5um的色譜柱的背壓卻是5um的2倍，因此如何選擇填料粒徑需要根據(jù)現(xiàn)實情況而定。本文來源于國內(nèi)的第三方檢測平臺嘉峪檢測網(wǎng)，提供檢測實驗、技術(shù)培訓(xùn)、儀器計量校準服務(wù)。

　　孔徑，60A，120A，300A等?？讖叫。瑒t含孔率高，比表面積大，載碳量高；色譜柱填料孔徑大小需和分子大小相匹配，保證分子自由進出填料孔并與孔內(nèi)表面的鍵合相進行分離分配，通常要求孔徑直徑是分子直徑的3倍以上，一般小分子使用80—120A，大分子使用300A。

　　顆粒形狀，一般有球形和不規(guī)則形，當(dāng)使用黏度較大的流動相時，球形顆?？梢越档椭鶋海娱L色譜柱壽命。

　　比表面積，指的是每克填料的表面積，如180m2/g—350m2/g，與粒度和含孔率有關(guān)；比表面積大，會增加樣品與鍵合相之間的反應(yīng)，增加保留和分離度；比表面積小則可以縮短分析時間和平衡時間，并不是比表面積大或者小就更好，需要選擇合適的比表面積。

　　化學(xué)性質(zhì)：

　　硅膠基質(zhì)：通用的基質(zhì)，強度大，化學(xué)修飾容易，但使用的pH值范圍有限(一般為2—8，特殊修飾的可以達到1—12)。

　　聚合物基質(zhì)：多為聚苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂，化學(xué)穩(wěn)定，應(yīng)用pH范圍寬，具有更強的疏水性，對蛋白質(zhì)等樣品分離效果較好；但強度較小，有機溶劑可能導(dǎo)致聚合物溶脹而受損，批次重復(fù)性較差，商品化色譜柱不多，一般價格較貴。

　　載碳量：基質(zhì)表面鍵合相的比例，載碳量高，則保留增加，適合分析非極性化合物。

　　鍵合相：鍵合試劑不同，對化合物的選擇性不同，一般長鏈的烷基鍵合相(C18C8)比短鏈的(C4C3)穩(wěn)定；非極性的鍵合相比極性的鍵合相(-NH2)穩(wěn)定。

　　封端：用短鏈將裸露的硅羥基鍵合后封閉起來，以減少殘留的硅醇基，減輕待測組分與酸性硅羥基反應(yīng)而引起的色譜峰拖尾現(xiàn)象。尤其對于極性樣品而言，未封端處理的色譜柱分離效果較差。　

	固定相極性	流動相極性	出峰順序
反相吸附色譜	非極性	強極性（水、甲醇、乙腈等）	強極性物質(zhì)先出峰
正相吸附色譜	極性	弱極性（己烷、庚烷等）	弱極性物質(zhì)先出峰

　　柱長及內(nèi)徑的選擇：

　　長度的選擇：柱越長，總柱效越高(n值越大)，柱越長，分析時間也越長。250—300mm是普遍的柱長，實驗室一半以上的工作都是采用此規(guī)格柱子，一般用來分離l0到50個組份的中等至復(fù)雜混合物；500—600mm，要求較高分辨率的應(yīng)用，—般用來分離大于50個組份或包含有難分離物質(zhì)的復(fù)雜樣品程序升溫分析。

　　內(nèi)徑：柱效率與柱半徑平方成反比，內(nèi)徑越小柱效越高，但內(nèi)徑越大，柱容量也增加，允許進樣量就越多。當(dāng)進樣量超過柱容量時，則因柱內(nèi)每塊理論板內(nèi)不能建立真正的平衡，將會導(dǎo)致色譜蜂畸變，柱分辨率降低，重現(xiàn)性不好。因此對于復(fù)雜樣品需要精確分離，必須使用小內(nèi)徑柱子。另一方面若樣品中存在具有很不相同濃度組份化合物，為了增加樣品容量就必須使用內(nèi)徑大的柱子，目前實驗室使用最常見的柱子內(nèi)徑一般是4.6mm。

　　一般選擇原則：分析大分子量化合物選擇大孔徑色譜柱；對于高pH值或者堿性化合物需要選擇高封端或者特殊封端的色譜柱，以改善峰形，延長色譜柱使用壽命等。

　　現(xiàn)在商品化的液相色譜柱琳瑯滿目，根據(jù)色譜柱的參數(shù)可以給我們提供一個初步的選擇，但由于各個儀器廠商的填料技術(shù)和鍵合技術(shù)都有差異，即使都是C18柱，同一品牌不同系列都有不同的功能，有能耐受低pH值的、有耐高溫的、有適合堿性樣品的等等。所以在選擇色譜柱前要好好研究色譜柱參數(shù)，仔細閱讀色譜柱說明書，才能找到合適的色譜柱和適宜的分離方法。

正相&反相色譜

　　目前市場上主要以反相色譜為主，約占80%的比例。

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