一、樣品預(yù)處理

1. 表面清潔

• 用無塵布蘸取乙醇或丙酮輕輕擦拭塑料表面，去除油污、灰塵等雜質(zhì)，避免干擾熒光信號。

• 若涂層為超薄或易損材質(zhì)，可改用去離子水沖洗后自然晾干。

2. 熒光標記（如涂層無自發(fā)熒光）

• 直接標記：若涂層含熒光基團（如熒光染料、量子點等），可直接觀察；若無，需通過化學偶聯(lián)（如氨基、羧基反應(yīng)）或物理吸附（如熒光納米粒子噴涂）對涂層進行熒光染色。

• 對照設(shè)置：制備未標記涂層的空白樣品，用于排除塑料基底自發(fā)熒光的干擾。

二、熒光顯微鏡設(shè)置

1. 光源與濾光片組選擇

• 根據(jù)涂層熒光染料的激發(fā) / 發(fā)射波長匹配濾光片，例如：

  染料類型	激發(fā)波長（nm）	發(fā)射波長（nm）	濾光片組合（示例）
  熒光素（FITC）	465-495	515-555	藍光激發(fā)（BP470-490）+
  			發(fā)射濾光片（LP515）
  羅丹明（Rhodamine）	510-560	590-630	綠光激發(fā)（BP530-550）+
  			發(fā)射濾光片（LP590）

• 若涂層成分未知，可先嘗試寬譜激發(fā)（如汞燈或 LED 白光），通過掃描不同濾光片組合篩選最佳信號。

2. 光路與參數(shù)調(diào)節(jié)

• 落射熒光模式：確保光源垂直入射，避免斜射導(dǎo)致涂層邊緣信號衰減。

• 光強與曝光時間：初始光強設(shè)為 30%-50%，曝光時間 50-200ms，避免強光導(dǎo)致熒光淬滅；若信號弱，可適當提高光強或延長曝光，但需同步觀察背景噪聲。

三、觀察與成像要點

1. 聚焦與掃描策略

• 低倍鏡定位：先用 10× 物鏡掃視全視野，標記涂層均勻區(qū)域或異常區(qū)域（如團聚、破損處），再切換 40× 或 63× 油鏡高倍觀察。

• Z 軸層掃（3D 重建）：若涂層有厚度（如微米級薄膜），可使用電動載物臺進行 Z 軸步進掃描（步長 0.5-1μm），通過軟件（如徠卡 LAS X）合成三維圖像，分析涂層厚度均勻性。

2. 特征記錄與分析

• 熒光分布：觀察涂層熒光強度是否均勻，記錄亮點（如染料聚集區(qū)）或暗區(qū)（如涂層缺失處）的位置與形態(tài)。

• 定量參數(shù)：通過軟件測量熒光強度平均值、標準差（反映均勻性）、熒光顆粒尺寸（如納米涂層的粒徑分布）等。

• 對比觀察：同時采集明場圖像，與熒光圖像疊加，關(guān)聯(lián)涂層形貌（如裂紋、孔隙）與熒光信號分布。

四、常見問題與解決方案

五、進階應(yīng)用：熒光共聚焦顯微（若需更高分辨率）

• 若涂層結(jié)構(gòu)精細（如納米級圖案或多層涂層），可使用激光共聚焦顯微鏡（如徠卡 TCS SP8），通過點掃描減少非焦平面光干擾，實現(xiàn)亞微米級分辨率，尤其適合分析涂層界面結(jié)合狀態(tài)或多層熒光標記的分層結(jié)構(gòu)。