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在復(fù)發(fā)性和難治性B細(xì)胞惡性腫瘤的治療中,應(yīng)用CD19 CAR-T細(xì)胞療法取得有效應(yīng)答，而FDA批準(zhǔn)的4種CD19 CAR-T細(xì)胞產(chǎn)品，在新的隨訪數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，只有30%-50%的患者實(shí)現(xiàn)了疾病的長期控制。為了提高B細(xì)胞惡性腫瘤的應(yīng)答率，并將CAR T細(xì)胞的成功轉(zhuǎn)化到實(shí)體瘤，故需對此類治療方法進(jìn)行優(yōu)化。

國外研究人員在Nature communications 期刊發(fā)表了題為The IgG4 hinge with CD28 transmembrane domain improves VHH-based CAR T cells targeting a membrane-distal epitope of GPC1 in pancreatic cancer的研究論文，通過設(shè)計(jì)靶向GPC1的CAR細(xì)胞，主要用于胰腺癌的治療。

Glypican-1 (GPC1)是一種糖基化磷脂酰肌醇錨定的細(xì)胞表面蛋白。在胚胎發(fā)育期間主要在神經(jīng)和骨骼系統(tǒng)中表達(dá)，并在成人組織中低水平表達(dá)。多項(xiàng)研究表明，GPC1在胰腺癌組織及癌旁成纖維細(xì)胞中表達(dá)升高，而在正常胰腺組織中表達(dá)很少?？笹PC1單克隆抗體已被用于開發(fā)抗體-藥物偶聯(lián)物(ADC)、免疫毒素、雙特異性T細(xì)胞結(jié)合物(BiTE)和抗GPC1陽性腫瘤細(xì)胞的CAR-T細(xì)胞，并且抗腫瘤效果已在臨床前模型中得到證實(shí)。

GPC1在胰腺癌中表達(dá)水平是不同的，在陽性的胰腺腫瘤組織中，GPC1弱陽性占51.4%，中度陽性占35.1%，強(qiáng)陽性占13.5%?？乖芏纫殉蔀橛绊慍AR-T細(xì)胞活性的主要因素。CAR-T細(xì)胞的效力高度依賴于靶抗原的表達(dá)，當(dāng)抗原表達(dá)水平較低或低于一定閾值時(shí)，CAR-T往往無法發(fā)揮其抗腫瘤活性

作者首先分離了一株單峰駱駝抗GPC1 VHH抗體D4(也稱為納米抗體)和一株單克隆抗體HM2 (mAb)，分別識(shí)別GPC1的膜遠(yuǎn)端和膜近端表位（圖1），并通過多組實(shí)驗(yàn)比較二者在療效上的區(qū)別。

圖1：D4-VHH和HM2抗體的發(fā)現(xiàn)

使用IVIS活體成像系統(tǒng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在兩種藥物處理細(xì)胞和小鼠后，發(fā)現(xiàn)D4 VHH和單克隆抗體HM2均可促進(jìn)有效的腫瘤殺傷和整體持久性，并且D4 VHH CAR-T細(xì)胞比HM2 CAR-T細(xì)胞多分泌2-7倍的細(xì)胞因子，包括IFN-γ、IL-2和TNF-α。所以D4 VHH-CAR-T具有更好的腫瘤清除率（圖2），值得更進(jìn)一步的研究。

圖2：HM2和D4 CAR處理后的小鼠腫瘤模型

由于GPC1靶向的CAR對低GPC1表達(dá)的T3M4癌細(xì)胞顯示出適度的抗腫瘤活性，而基于D4 VHH的CAR易表達(dá)，其轉(zhuǎn)導(dǎo)效率比基于HM2的CAR高近40%。所以作者設(shè)計(jì)了基于D4 VHH的GPC1 CAR。作者將45個(gè)氨基酸的CD8H替換為短的12個(gè)氨基酸修飾的IgG4H。為了充分研究間隔區(qū)長度對CAR-T細(xì)胞活化的影響，又構(gòu)建了兩個(gè)額外的D4 CAR，其中依次添加修飾的IgG4-Fc間隔區(qū)，得到D4-IgG4H-CH3（中）和D4-IgG4H-CH2CH3(長)。這三種基于D4-IgG4H的CAR都含有CD28 TM結(jié)構(gòu)域。

使用IVIS活體成像系統(tǒng)，比較了不同間隔長度CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤活性。發(fā)現(xiàn)IgG4H的D4 CAR-T細(xì)胞治療小鼠，在治療2周內(nèi)腫瘤迅速消退。同樣劑量表達(dá)中間隔或長間隔的D4 CAR-T細(xì)胞在消除小鼠癌細(xì)胞方面效果較差（圖3）。總之，D4-IgG4H-CD28TM CAR-T細(xì)胞在低GPC1抗原密度的胰腺癌細(xì)胞中顯示出增強(qiáng)的抗腫瘤效果。

圖3：D4-IgG4H-CD28TM和不同間隔長度的CAR-T細(xì)胞抗腫瘤活性

緊接著作者又研究了抗GPC1抗體克隆1-12的GPC1 CAR-T細(xì)胞的抗腫瘤作用。D4-IgG4H-CD28TM和克隆1-12-IgG4H-CD28TM CAR的表達(dá)通過hEGFRt表達(dá)和GPC1結(jié)合，與hEGFRt表達(dá)(67%)相比，通過GPC1結(jié)合測定的D4 CAR表達(dá)(58%)有小幅下降。通過檢測任一標(biāo)記，克隆1-12 CAR顯示出相同的表達(dá)水平(60%)。與D4-IgG4H-CD28TM CAR-T細(xì)胞相比，克隆1-12-IgG4H-CD28TM CAR-T細(xì)胞的CD8+T細(xì)胞百分比略高。同步比較了D4和IgG4H-CD28TM CAR構(gòu)建中克隆1-12對低表達(dá)GPC1的胰腺癌細(xì)胞的殺傷效果。

使用IVIS活體成像系統(tǒng)，對Panc-1原位胰腺癌小鼠模型評估了兩種CAR的療效。截至第2周，D4-IgG4H-CD28TM和克隆1-12-IgG4H CD28TM CAR-T細(xì)胞均以相當(dāng)?shù)寞熜дT導(dǎo)腫瘤消退。并且在第4周，D4-IgG4H-CD28TM CAR-T細(xì)胞對腫瘤達(dá)到100%殺傷。

圖4：對Panc-1原位胰腺癌小鼠模型進(jìn)行評估

此外，在T3M4 i.p異種移植小鼠模型中，D4-IgG4H-CD28TM CAR-T細(xì)胞更有效地抑制腫瘤生長，比克隆1-12-IgG4H-CD28TM CAR-T細(xì)胞對腫瘤的殺傷力更強(qiáng)（圖5）。最后,D4-IgG4H-CD28TM CAR-T對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果，也在Bxpc3 ip異種移植小鼠模型得到了同樣的趨勢(圖5)。證明了D4-IgG4H-CD28TM CAR-T細(xì)胞比克隆1-12-IgG4H-CD28TM CAR-T細(xì)胞有著更有效的抗腫瘤功效。

圖5：分別在T3M4 i.p和Bxpc3 i.p異種移植小鼠模型中觀察抗腫瘤功效

作者最終證明用較短的IgG4H替代較長的CD8H可顯著改善D4 CAR-T細(xì)胞的活性。此外，通過研究H (CD8和IgG4)和TM (CD8和CD28)對D4 CAR-T細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)IgG4H-CD28TM介導(dǎo)D4 CAR二聚化，導(dǎo)致低抗原密度胰腺癌模型中T細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)增強(qiáng)和腫瘤消退。此外，高功能的CD8+ D4-IgG4H-CD28TM CAR-T細(xì)胞分泌更多的IL-2和IL-7，并表現(xiàn)出對T細(xì)胞長期持續(xù)存在重要基因(例如ID1)的表達(dá)增加。這項(xiàng)工作提供了一種策略來優(yōu)化膜遠(yuǎn)端表位的識(shí)別，并改善基于納米抗體的CAR T細(xì)胞在實(shí)體瘤中的功能。

參考文獻(xiàn)

Nan Li,Alex Quan,Dan Li,Jiajia Pan,Hua Ren,Gerard Hoeltzel,Natalia,Val,Dana Ashworth,Weiming Ni,et al.The IgG4 hinge with CD28 transmembrane domain improves VHH-based CAR T cells targeting a membrane-distal epitope of GPC1 in pancreatic cancer. Nature Communications 14, Article number: 1986 (2023)