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本文來源于微信公眾：生化尋蹤 作者：生化尋蹤
過去十幾年中，F(xiàn)DA批準的所有ADC都是由不同數(shù)量的藥物附著在單克隆抗體不同位置的ADC混合而成的。目前業(yè)界已經(jīng)開發(fā)了一系列新的偶聯(lián)策略，旨在控制有效載荷的鏈接位置和數(shù)量，同時保持結(jié)構(gòu)完整性和同質(zhì)性。
目前，偶聯(lián)技術(shù)可分為2類：①利用抗體序列中天然的具備反應(yīng)活性的氨基酸殘基來介導(dǎo)的偶聯(lián)技術(shù)，包括抗體表面賴氨酸的側(cè)鏈氨基和鏈間二硫鍵還原后的巰基；②利用基因工程技術(shù)、化學(xué)修飾或酶修飾等在抗體特定位點引入可供反應(yīng)的基團，再偶聯(lián)載荷毒素，實現(xiàn)特定位點偶聯(lián)，此類偶聯(lián)包括工程化半胱氨酸定點偶聯(lián)技術(shù)、非天然氨基酸定點偶聯(lián)技術(shù)、 酶介導(dǎo)的定點偶聯(lián)技術(shù)、糖鏈介導(dǎo)的定點偶聯(lián)技術(shù)等。
第一代抗體偶聯(lián)技術(shù)（隨機偶聯(lián)）
傳統(tǒng)的 ADC 利用抗體賴氨酸的氨基或打開鏈間二硫鍵獲得的半胱氨酸的巰基進行偶聯(lián)。一個抗體分子包含了 80 ~ 90 個賴氨酸，偶聯(lián)可能會發(fā)生在將近 40 個不同賴氨酸殘基上，打開鏈間二硫鍵會得到多個半胱氨酸殘基，同時破壞了抗體分子的完整性，因此傳統(tǒng)的 ADC 是高度異質(zhì)混合物，其均一性差，穩(wěn)定性低，影響藥效及治療窗。
第二代抗體偶聯(lián)技術(shù)
通過引入生物正交分子到抗體中，然后利用引進的特殊位點進行定點偶聯(lián)，但是這些特殊位點的引進往往需要對抗體進行改造，這可能會改變抗體的部分性質(zhì)，甚至?xí)淖兛贵w的折疊或者穩(wěn)定性。
1. 引入反應(yīng)性半胱氨酸（THIOMAB技術(shù)）
Genentech最早利用了一種名為THIOMAB的定點偶聯(lián)技術(shù)，通過基因工程在抗體的特定點插入半胱氨酸殘基，在還原性條件下，引入的半胱氨酸及鏈間的二硫鍵被還原，在CuSO4的作用下氧化并再次形成二硫鍵，形成位點專一的抗體偶聯(lián)藥物。
Thiomab 技術(shù)，工程化引入半胱氨酸，既不會干擾免疫球蛋白的折疊和組裝，也不會改變抗體抗原的結(jié)合模式，獲得的ADC藥物既保留了其體內(nèi)抗腫瘤活性，還提高了耐受性、降低了系統(tǒng)毒性。該技術(shù)具有高均一性、較好的反應(yīng)活性和穩(wěn)定性等優(yōu)點，缺點是需要基因修飾，通常DAR 2。
基于此，Seattle Genetics 和 Spirogen 開發(fā)了一種類似的技術(shù)，稱為 MAIA，通過在 mAb 關(guān)鍵區(qū)域的 239 位引入絲氨酸-半胱氨酸突變，用于其 PBD 二聚體的生物綴合。
2. 引入非天然氨基酸
通過在抗體的原始序列中人工加入非天然氨基酸，使其在抗體表面呈現(xiàn)出可方便偶聯(lián)的特異性位點，從而獲得位點確定、DAR值均一的ADC。該偶聯(lián)技術(shù)du特之處在于可以隨意突變非天然氨基酸，并且得到任意DAR值的ADC，缺點是需要基因修飾、抗體表達量低、非天然氨基酸序列引起免疫原性和非天然氨基酸的疏水性引起聚集。
引入的非天然氨基酸通常為乙酰苯丙氨酸、疊氮基甲基-L-苯基丙氨酸和疊氮賴氨酸。非天然氨基酸上帶有的酮基、疊氮基官能團可與藥物連接子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，獲得 DAR 均一的 ADC。
3. 酶法偶聯(lián)
抗體和小分子藥物可以利用酶法實現(xiàn)定點偶聯(lián)。酶法偶聯(lián)具備定點偶聯(lián)的優(yōu)勢，但也存在引入額外序列而造成免疫原性的潛在弊端。因此，在產(chǎn)品開發(fā)過程中，需要對生成的 ADC 進行完善的免疫原性評估以確保其安全性。
第三代抗體偶聯(lián)技術(shù)
第二代抗體偶聯(lián)技術(shù)雖然可以實現(xiàn)對抗體進行定點偶聯(lián)，但是需要對抗體進行特殊改造，這在一定程度上可能會給ADC藥物的開發(fā)帶來一些新的挑戰(zhàn)，因此有研究者開始考慮在不改變抗體完整的基礎(chǔ)上，對天然的抗體進行位點特異性偶聯(lián)。第三代偶聯(lián)技術(shù)主要是聚焦于選擇du特的氨基酸位點并利用du特的分子或者通過鄰近效應(yīng)進行定點偶聯(lián)，其主要分為以下4種：1）鏈間二硫鍵改造；2）糖基修飾；3）化學(xué)選擇性的修飾；4）基于鄰近效應(yīng)的修飾。
1. 二硫鍵重橋
二硫鍵重橋，又名 Disulfide re-bridging，是利用半胱氨酸選擇性交聯(lián)試劑（如TECP或DTT），將IgG1抗體中4個鏈間二硫鍵還原，隨后使用雙反應(yīng)試劑在多肽鏈重新連接的同時，完成小分子有效載荷的安裝或抗體的進一步修飾。通過共價重新連接半胱氨酸殘基，既維持了二硫鍵的穩(wěn)定作用，同時實現(xiàn)每個二硫鍵鏈接一個有效載荷的受控偶聯(lián)。
該偶聯(lián)方式具有高均一性、不影響抗體的空間結(jié)構(gòu)、通用的氨基酸序列與糖基化修飾等優(yōu)點，缺點是鏈內(nèi)錯誤橋接，通常DAR 4。
根據(jù)偶聯(lián)試劑的不同分類分為4類：單/雙砜類試劑； 3,4-二取代馬來酰亞胺；二溴噠嗪二酮和; 二乙烯基嘧啶。
2. 糖基偶聯(lián)
IgG型抗體中存在兩個保守的糖基化位點N297，該位點位于CH2結(jié)構(gòu)域，遠離抗體結(jié)合抗原的功能結(jié)構(gòu)域，因此利用該位點進行偶聯(lián)不會對抗體的結(jié)合功能造成影響。
ADC的糖基化偶聯(lián)技術(shù)不改變抗體的結(jié)構(gòu)，無需進行抗體工程化改造、不引入非天然氨基酸和特定的氨基酸序列突變以便進行偶聯(lián)。目前可用Fc端糖基化偶聯(lián)技術(shù)有：糖基氧化的修飾、糖代謝工程、酶工程等?？偟膩碚f，利用該糖位點的偶聯(lián)，主要是通過在糖基上引入一個新的反應(yīng)基團，然后再利用相關(guān)試劑進行定點偶聯(lián)。
2.1 基于糖基的氧化的修飾
Fc端糖基的核心可以通過選擇性高碘酸鹽氧化修飾，然后與酰肼毒素小分子反應(yīng)，形成具有完整免疫反應(yīng)性的腙連接綴合物。這個技術(shù)早在gemtuzumab ozogamicin開發(fā)的時候就曾使用過，但抗體的敏感性導(dǎo)致了在氧化過程中抗體活性的損失，所以才采用的AcBut連接子的賴氨酸隨機偶聯(lián)技術(shù)。
2.2 代謝工程化修飾抗體寡糖
通過代謝工程修飾抗體寡糖，在細胞培養(yǎng)基中摻入巖藻糖類似物6-硫代過乙酸鹽，以這種方式在糖基的核心處引入巰基，巰基可以作為使用馬來酰亞胺化學(xué)連接連接子-載荷的錨定點。
2.3 酶工程化修飾抗體寡糖
利用糖基轉(zhuǎn)移酶，主要是通過在糖基上引入一個新的反應(yīng)基團，然后再利用相關(guān)試劑進行定點偶聯(lián)。目前擁有酶工程糖基化偶聯(lián)技術(shù)的公司也有多家，包括Syniffix，康寧杰瑞和糖嶺生物等，但是具體使用的酶和linker接頭均有所不同。
根據(jù)巖唐生物披露信息，其YTConju™技術(shù)平臺通過對抗體Fc區(qū)域保守的糖基化位點進行酶化學(xué)法改造，并利用高效的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶和改構(gòu)后的巖藻糖衍生物實現(xiàn)了“一步法"偶聯(lián)。
康寧杰瑞研發(fā)了具有自主知識產(chǎn)權(quán)，基于抗體CH2結(jié)構(gòu)域糖鏈的定點偶聯(lián)技術(shù)，采用一酶兩步法，核心步驟為在β-1,4-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下，UDP-GalNAz被轉(zhuǎn)移至抗體的末端已酰葡萄糖胺上，從而引入疊氮基團，進而為payload通過點擊化學(xué)的方法偶聯(lián)至抗體上。但對于抗體糖鏈末端的結(jié)構(gòu)如何做到統(tǒng)一（抗體制備過程控制策略），是否需額外修飾，并無太多信息披露。
康寧杰瑞
Synaffix公司創(chuàng)建的GlycoConnect™技術(shù)，包括用EndoS修剪Fc糖鏈，隨后轉(zhuǎn)移GalNAz或疊氮-半乳糖基團，以及最終點擊連接子-載荷。結(jié)合多種連接子-載荷選項，這項技術(shù)已被多家合作公司用來生成DAR 2的均質(zhì)gsADC。
3. 化學(xué)選擇性修飾（略）
4. 鄰近誘導(dǎo)抗體偶聯(lián)技術(shù)
探針和蛋白質(zhì)的特定天然殘基（例如，賴氨酸、半胱氨酸、絲氨酸）之間進行選擇性反應(yīng)的鄰近的偶聯(lián)方法正在成為一類重要的抗體偶聯(lián)方法。這些策略能夠制備位點特異性抗體偶聯(lián)物，而無需額外的抗體工程或額外修改。目前基于鄰近的偶聯(lián)的努力方向主要集中在新的鄰近誘導(dǎo)化學(xué)以及對抗體結(jié)構(gòu)和功能的破壞較小的抗體結(jié)合劑上。
5. 其他偶聯(lián)技術(shù)
賴氨酸與半胱氨酸作為廣泛使用的靶標，在化學(xué)反應(yīng)方面具有顯著優(yōu)勢。然而，異質(zhì)性問題對其藥效性質(zhì)產(chǎn)生了負面影響，進而影響毒性表現(xiàn)。基于內(nèi)源性氨基酸的化學(xué)替代方法。其中，因酪氨酸、色氨酸、組氨酸的芳香族側(cè)鏈表現(xiàn)出du特的反應(yīng)性和選擇性，多種基于芳香族側(cè)鏈改性的化學(xué)技術(shù)應(yīng)運而生。
5.1 蛋氨酸（ReACT）
蛋氨酸是一種主要負責(zé)保護人體免受氧化應(yīng)激的氨基酸。因此，與其他氨基酸殘基相比，其功能化不太可能損害蛋白質(zhì)的功能。另一個優(yōu)勢是蛋氨酸的豐度較低(約1.8%)，這降低了特定標記的概率。但發(fā)現(xiàn)所得蛋氨酸偶聯(lián)物的穩(wěn)定性一般，需要進一步優(yōu)化才能成功應(yīng)用于ADC 領(lǐng)域。
5.2 酪氨酸
廣泛的雙正交標記策略是基于酪氨酸(Tyr)的苯酚側(cè)鏈上的選擇性化學(xué)。酪氨酸出現(xiàn)在蛋白質(zhì)序列的頻率中等 (自然豐度為3.3%)，從而為其du特的苯酚側(cè)鏈的位點選擇性標記提供了機會。盡管酪氨酸通常部分埋藏在蛋白質(zhì)表面，但它也可以參與氫鍵，并且由于其氧化還原潛力，可以形成酪氨酸自由基，使電子轉(zhuǎn)移。因此，酪氨酸殘基經(jīng)歷了高度多樣化的生物修飾，如硝化、氧化、交聯(lián)、AMP化、鹵化或糖基化。
