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超濾離心管操作全解析:從離心參數(shù)到回收率提升的實(shí)戰(zhàn)指南

閱讀:459發(fā)布時(shí)間:2025-5-30

  一、超濾離心管離心參數(shù)優(yōu)化
 
  轉(zhuǎn)速與時(shí)間
 
  初次離心建議以推薦轉(zhuǎn)速的70%起步(如3000×g離心10分鐘),觀察流速后逐級調(diào)整至4000×g,但不得超過濾膜耐受極限。
 
  典型處理時(shí)間為10-30分鐘,具體取決于截留分子量(MWCO)和樣本體積。
 
  溫度控制
 
  離心機(jī)需預(yù)冷至4℃,減少熱變性吸附。低溫環(huán)境可延長膜使用壽命,但需注意濃縮時(shí)間可能延長。
 
  加速度與平衡
 
  離心加速度調(diào)至最低檔,減小對膜的壓力。
 
  確保配對的超濾管質(zhì)量與重心平衡,濾芯的放置位置和方向一致,避免離心過程中晃動或損壞。
 
  二、回收率提升策略
 
  濾膜選擇與預(yù)處理
 
  根據(jù)目標(biāo)分子量選擇MWCO比目標(biāo)分子小2-3倍的超濾膜。例如,目標(biāo)蛋白分子量為35kDa時(shí),選擇10kDa截留分子量的超濾管。
 
  新購超濾離心管的超濾膜含有微量甘油,使用前需用純水或緩沖液浸泡并置于冰箱預(yù)冷10分鐘。之后倒出純水,再將超濾管置于冰上預(yù)冷2-5分鐘。
 
  樣本處理與加樣
 
  樣本提前用0.22μm濾膜過濾,避免顆粒物堵塞超濾膜。
 
  將樣本緩慢加入超濾管,液面不超過最大標(biāo)線。加樣時(shí)操作要輕,避免破壞膜結(jié)構(gòu)。
 
  濃縮與洗脫
 
  離心過程中每5分鐘暫停,用移液槍輕柔吹打截留層,防止大分子堆積形成濃差極化層。
 
  截留體積控制在原始樣本量的1/10至1/20。濃縮倍數(shù)過高易導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集,可在超濾中途添加緩沖液進(jìn)行置換,分階段濃縮。
 
  對于黏稠樣本(如含甘油或蔗糖),需降低轉(zhuǎn)速10%-20%,延長離心時(shí)間。
 
  回收操作
 
  離心后,大分子留在上層,小分子和溶劑通過膜進(jìn)入下層。外管濾液為小分子物質(zhì)和溶劑;內(nèi)管液體為大分子物質(zhì)。
 
  如需收集大分子物質(zhì),則另取外管,內(nèi)管倒置1000×g離心1-2分鐘。
 
  三、常見問題與解決方案
 
  漏蛋白或檢測不到蛋白
 
  原因:濾膜選擇不當(dāng)、離心參數(shù)不合適、樣本初始濃度過低等。
 
  解決方案:重新選擇合適的MWCO濾膜,調(diào)整離心參數(shù),確保樣本初始濃度大于25μg/ml。
 
  膜堵塞或流速過慢
 
  原因:樣本中顆粒物過多、濾膜污染等。
 
  解決方案:樣本提前過濾,定期清洗或更換濾膜。發(fā)現(xiàn)膜堵塞時(shí),用0.1M NaOH浸泡1小時(shí),再用純水沖洗三次。
 
  回收率低
 
  原因:濾膜吸附性、操作不當(dāng)?shù)取?br /> 
  解決方案:提前用1% BSA封閉濾膜30分鐘,減少非特異性吸附。操作時(shí)注意輕柔,避免破壞膜結(jié)構(gòu)。
 
  超濾后截留液出現(xiàn)沉淀
 
  原因:蛋白質(zhì)濃度過高、Buffer不合適等。
 
  解決方案:用多根超濾管同時(shí)超濾,降低濃度;換不同的Buffer,直到蛋白不發(fā)生沉淀為止。對于沉淀,可用8M尿素溶解后再次離心。
 
  四、維護(hù)與保養(yǎng)
 
  清洗與消毒
 
  一次性使用的超濾離心管,使用后直接丟棄。
 
  如需重復(fù)使用,使用完的超濾管用純水反復(fù)清洗5次,再用0.1M NaOH浸泡1-2小時(shí),隨后用20%乙醇清洗,并用超純水或緩沖液清洗3次。一般不建議重復(fù)使用超濾管超過5次。
 
  長期保存
 
  短期保存:用0.1M NaOH浸泡1-2小時(shí),純水清洗3次,然后用75%乙醇浸泡,務(wù)必使濾膜保持濕潤,不能長菌。
 
  長期保存:用0.1M NaOH浸泡1-2小時(shí),純水清洗3次,然后用20%乙醇浸泡,務(wù)必使濾膜保持濕潤,不能長菌。

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