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一直被模仿，從未被超越丨Agilent MHC 2D-LC /MS 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)專題 2 - 多肽和寡核苷酸藥學(xué)研究
上期我們一同回顧了 Agilent MHC 2D-LC 發(fā)展歷史及深入的技術(shù)介紹，并分享了 MHC 2D-LC/6230 TOF 液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)在蛋白領(lǐng)域的應(yīng)用成果，本期將聚焦于多肽（Peptide）和寡核苷酸（Oligo）藥學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用。
圖 1. Agilent MHC 2D-LC/TOF 示意圖
在多肽和寡核苷酸的藥學(xué)研究工作中，有關(guān)物質(zhì)分析鑒定和 QC 方法建立是行業(yè)共識(shí)的難題。由于雜質(zhì)和 API 的性質(zhì)極為相似，以及“差向肽”或寡核苷酸硫代造成的非對(duì)映異構(gòu)體雜質(zhì)等，單一的液相色譜方法往往會(huì)存在雜質(zhì)和主峰共洗脫或者分離度低的問題，因此通常需要借助互補(bǔ)的檢測(cè)技術(shù)如 LC-UV-MS 聯(lián)用以及多個(gè)正交的液相色譜方法來進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)的控制。主峰峰純度確認(rèn)和雜質(zhì)分析鑒定是 Peptide和Oligo 藥物 QC 工作的基礎(chǔ)。
HiRes 進(jìn)行主峰純度確認(rèn)
國(guó)家藥監(jiān)局藥品審評(píng)中心發(fā)布的《化學(xué)合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》1 中提出使用液質(zhì)聯(lián)用方法對(duì)多肽主峰純度進(jìn)行研究，以及使用正交方法進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)分析。為了有效分離檢測(cè)到 0.1% 的低含量雜質(zhì)，往往需要增大 API 進(jìn)樣量（大于 0.5 mg/mL），這樣會(huì)造成主峰過載，從而大大降低雜質(zhì)峰與主峰的分離度，造成無(wú)法對(duì)雜質(zhì)峰進(jìn)行準(zhǔn)確定量或者質(zhì)譜離子化抑制的問題。
解決辦法就是使用 HiRes 模式（圖 2）：將主峰連續(xù)切割為 10 片依次進(jìn)入第二維色譜進(jìn)行分析，相當(dāng)于把主峰的濃度降低了 10 倍，解決了主峰“掩蓋”雜質(zhì)峰的問題。如果在第二維應(yīng)用正交方法，還可以將差向異構(gòu)肽等有關(guān)物質(zhì)實(shí)現(xiàn)分離和分別定量。
圖 2. 對(duì)目標(biāo)峰的連續(xù)存儲(chǔ)的 HiRes 模式
ASM 進(jìn)行一維質(zhì)譜不兼容體系的雜質(zhì)鑒定
與蛋白不同，Peptide 和 Oligo 一維分離時(shí)會(huì)用到有機(jī)溶劑或高鹽體系，當(dāng)切割的組分含有機(jī)相或高鹽時(shí)，會(huì)在二維上保留變差甚至沒有保留，導(dǎo)致質(zhì)譜信號(hào)降低；特別是 Oligo，當(dāng)使用 2D-LC/MS 對(duì) Oligo 陰離子交換分離（會(huì)用到高濃度 NaCl 或 NaClO4 質(zhì)譜不兼容的鹽）的色譜峰進(jìn)行質(zhì)譜鑒定時(shí)，一維組分中的高濃度的鹽會(huì)影響 Oligo 在二維反相離子對(duì)的保留，在此推薦使用 ASM（圖 3）功能可降低二維上樣時(shí)的鹽濃度，保證一維組分能在二維上有保留進(jìn)而實(shí)現(xiàn)質(zhì)譜鑒定。
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圖 3. ASM 管路為 1uL 的分流比 4:1
Agilent MHC 2D-LC/Q-TOF
大分子表征的應(yīng)用案例-Peptide
MHC 應(yīng)用案例
司美格魯肽雜質(zhì)鑒定
一維分離：Infinity II 1260 生物惰性液相色譜（四元），配備 VWD 檢測(cè)器
反相分離，A 相：0.088M 磷酸二氫銨溶液（pH 3.6）：乙腈=9：1（V：V，pH 3.8±0.1），B相：乙腈
二維分離：Infinity II 1290 超高效液相色譜系統(tǒng)（二元），質(zhì)譜兼容的反相體系
質(zhì)譜：6545XT AdvanceBio Q-TOF
數(shù)據(jù)采集及處理軟件：Masshunter 及 BioConfirm 12.1
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
對(duì)司美格魯肽主峰前后的 10 個(gè)雜質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，其中 Cut6 的一級(jí)分子量比主成分多 106Da，結(jié)合文獻(xiàn)并使用 BioConfirm12.1 軟件自定義編輯修飾進(jìn)行匹配，鑒定結(jié)果顯示該修飾發(fā)生在 25 位上的色氨酸（Trp）上（紅色方框所示）發(fā)生羥基芐基化修飾，其 y6 離子與主成分一致，而 y7、y8 以及 y9 等均比主成分多 106Da，進(jìn)一步說明修飾發(fā)生在 25 位-Trp上。
圖 4. 司美格魯肽雜質(zhì)鑒定的一級(jí)質(zhì)譜圖以及雜質(zhì)（25 色氨酸-羥基芐基化修飾）二級(jí)質(zhì)譜匹配圖
HiRes MHC 應(yīng)用案例
司美格魯肽主峰純度研究
一維分離：Infinity II 1260 生物惰性液相色譜（四元），配備 VWD 檢測(cè)器
反相分離，A 相：0.088M 磷酸二氫銨溶液（pH 3.6），乙腈=9：1（V：V，pH 3.8±0.1）；B相：乙腈
二維分離：Infinity II 1290 二元超高效系統(tǒng)，質(zhì)譜兼容的反相體系
質(zhì)譜：6545XT AdvanceBio Q-TOF
數(shù)據(jù)采集及處理軟件：Masshunter 及 BioConfirm12.1
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
1 針進(jìn)樣，使用 HiRes 對(duì)司美格魯肽主峰進(jìn)行連續(xù) 10 片切割（從色譜峰的起始至結(jié)束）。該 10 片組分依次通過第二維色譜系統(tǒng)洗脫至質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)。以 cut1 為例，cut1 中包含比主峰小 101Da 的雜質(zhì)，通過解卷積后的質(zhì)譜含量為 75%（主峰解卷積響應(yīng)/（主峰解卷積響應(yīng)+雜質(zhì)解卷積響應(yīng)））。綜合所有 10 個(gè) cuts 的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，得出主峰的質(zhì)譜純度為 99.72%。
圖 5. HiRes 應(yīng)用案例 司美格魯肽主峰純度分析的色譜圖以及質(zhì)譜純度結(jié)果
Agilent MHC 2D-LC/6230 TOF
大分子表征的應(yīng)用案例-Oligo
MHC 配備 ASM 應(yīng)用案例
Oligo 陰離子交換色譜峰的質(zhì)譜鑒定
一維分離：Infinity II 1260 生物惰性液相色譜（四元），配備 VWD 檢測(cè)器
離子交換分離，A 相：20mM Tris-HCl（pH 8.5），B 相：1M NaClO4 溶解在 A 相
二維分離：Infinity II 1290 二元超高效系統(tǒng)，質(zhì)譜兼容的反相體系，使用 ASM 功能降低上樣時(shí)的鹽濃度，保證 oligo 在二維反相離子對(duì)體系的保留，實(shí)現(xiàn)質(zhì)譜鑒定
質(zhì)譜：Agilent 6230 TOF
數(shù)據(jù)采集及處理軟件：Masshunter 及 BioConfirm12.1
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
使用帶有 ASM 功能的 MHC 系統(tǒng)，1 針進(jìn)樣對(duì) Oligo 樣品主峰前后 9 個(gè)不同時(shí)間段進(jìn)行鑒定，如圖所示 cut1 和 cut2 的解卷積后分子量差值為 535.1Da，可根據(jù)序列信息進(jìn)一步推測(cè)雜質(zhì)類型。
圖 6. Oligo 雜質(zhì)分析的色譜結(jié)果以及部分解卷積結(jié)果
Agilent MHC 2D-LC /MS 系統(tǒng)將會(huì)不斷完善和創(chuàng)新，持續(xù)助力 Peptide 和 Oligo 等藥物研發(fā)進(jìn)程。
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獨(dú)特的 MHC 切割組件結(jié)合 Masshunter 軟件，在 MHC 模式下實(shí)現(xiàn)最多 11 個(gè)峰的智能存儲(chǔ)并通過二維洗脫并進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，節(jié)約樣品，提高分析通量；
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獨(dú)特的 MHC 切割組件結(jié)合 Masshunter 軟件，在 HiRes 模式對(duì) Peptide 或 Oligo 等進(jìn)行主峰純度評(píng)估，將包含在主峰中的雜質(zhì)或通過二維分離開進(jìn)行質(zhì)譜鑒定或通過降低主峰的信號(hào)抑制而實(shí)現(xiàn)質(zhì)譜鑒定；
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MHC 組件中的 ASM 功能，可降低二維分離時(shí)的溶劑效應(yīng)或鹽效應(yīng)，保證目標(biāo)峰在二維的保留，有助于提高質(zhì)譜響應(yīng)用于質(zhì)譜鑒定。
參考文獻(xiàn)：
1. 國(guó)家藥監(jiān)局藥審中心，化學(xué)合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行），2023 年 2 月