超微量核酸定量分析儀（如超微量核酸蛋白測定儀）對蛋白的測試主要基于紫外-可見分光光度法，通過測量蛋白質(zhì)在特定波長（如280nm）的吸光度來估算其濃度。以下是其測試蛋白的具體方法及關(guān)鍵步驟：
一、測試原理
蛋白質(zhì)分子中的色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）殘基以及Cys-Cys二硫鍵在280nm波長處有顯著吸收。儀器通過測量蛋白質(zhì)溶液在280nm處的吸光度（A280），結(jié)合朗伯-比爾定律，直接計(jì)算蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）。此方法無需構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，但需確保樣品中不含其他在280nm處有強(qiáng)吸收的雜質(zhì)（如核酸、酚類物質(zhì)）。
二、操作步驟
儀器準(zhǔn)備
連接電源，啟動儀器，預(yù)熱5-10分鐘至穩(wěn)定狀態(tài)。
選擇“蛋白A280”檢測模式，并設(shè)置光程（通常為10mm，但儀器可能自動調(diào)整）。
使用高純度蒸餾水或空白緩沖液進(jìn)行零點(diǎn)校準(zhǔn)，消除背景干擾。
樣品處理
樣品量：建議使用2μL樣品（部分儀器支持0.5-2μL微量檢測），確保形成穩(wěn)定液柱。
避免氣泡：點(diǎn)樣時輕觸檢測孔底部，緩慢釋放液體，防止氣泡影響吸光度測量。
表面張力：若樣品表面張力低（如含去污劑），可增加樣品量至4μL以保證液柱穩(wěn)定性。
空白對照
取2μL空白溶液（如緩沖液）加至下基座，放下上基座并點(diǎn)擊“空白”按鈕，記錄背景吸光度。
擦拭基座，確保無殘留液體。
樣品檢測
取2μL待測樣品加至下基座，放下上基座并點(diǎn)擊“樣品”按鈕。
儀器自動測量吸光度并計(jì)算濃度，結(jié)果通常以mg/ml為單位顯示。
高濃度樣品：若吸光值超過儀器量程（如光強(qiáng)<200），需稀釋樣品后重新檢測。
數(shù)據(jù)記錄與清理
保存檢測結(jié)果，并導(dǎo)出為CSV或PDF格式。
用無塵布擦拭基座，避免交叉污染。
三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)
基線校準(zhǔn)
默認(rèn)基線校準(zhǔn)波長為340nm，用戶可根據(jù)需要調(diào)整。
必須在樣品檢測前完成校準(zhǔn)，否則光譜值將偏移，導(dǎo)致濃度計(jì)算錯誤。
樣品純度
避免樣品中含核酸、酚類或高濃度鹽離子，這些物質(zhì)可能在280nm處產(chǎn)生干擾吸收。
若需檢測含雜質(zhì)樣品，可結(jié)合比色法（如BCA、Bradford法）或使用雙波長（280nm/340nm）扣除背景。
儀器維護(hù)
光源：避免長時間曝光，不使用時關(guān)閉光源以延長壽命。
單色器：定期更換干燥劑（如硅膠），防止色散元件受潮生霉。
檢測器：防止強(qiáng)光直射或受潮積塵，保持清潔。
環(huán)境：儀器應(yīng)放置在干燥、穩(wěn)定的工作臺上，遠(yuǎn)離空調(diào)出風(fēng)口或直射陽光，溫度控制在25℃±2℃。
特殊樣品處理
冷凝樣品：采用45度斜面貼壁緩慢加載，防止溢出或牛頓環(huán)干擾。
多糖類物質(zhì)：檢測后需用乙醇試劑沖洗液路，避免殘留。
油脂樣品：若發(fā)生上浮現(xiàn)象，需先低溫離心分離后再檢測。
四、應(yīng)用場景與優(yōu)勢
快速定量：無需復(fù)雜前處理，2-5分鐘內(nèi)完成檢測，適合高通量篩選。
微量檢測：僅需0.5-2μL樣品，節(jié)省珍貴樣本（如臨床標(biāo)本、稀有蛋白）。
多參數(shù)分析：部分儀器支持同時檢測A260（核酸）、A280（蛋白）及OD600（細(xì)菌濃度），實(shí)現(xiàn)多組分定量。
便攜性：緊湊設(shè)計(jì)，適用于現(xiàn)場檢測或移動實(shí)驗(yàn)室。
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