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試劑盒組成及作用

Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡/周期檢測試劑盒主要包含 Annexin V-FITC、PI 和結(jié)合緩沖液。Annexin V-FITC 是將 Annexin V 與 FITC 標(biāo)記形成的復(fù)合物，PI 是一種核酸染料。結(jié)合緩沖液含有鈣離子，可為 Annexin V 與 PS 結(jié)合提供適宜環(huán)境，維持細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定，減少非特異性結(jié)合。

工作原理

細(xì)胞膜的不對稱性和 PS 的外翻

正常細(xì)胞膜的磷脂分布具有不對稱性，磷脂酰絲氨酸（PS）位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)。細(xì)胞凋亡時，PS 會在早期從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到外側(cè)，這一變化是檢測細(xì)胞凋亡的重要標(biāo)志之一。

Annexin V-FITC 與 PS 的結(jié)合

Annexin V 是一種鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白，對 PS 具有高親和力。在細(xì)胞凋亡早期，Annexin V-FITC 可與外翻至細(xì)胞膜外側(cè)的 PS 結(jié)合，從而識別早期凋亡細(xì)胞。

PI 的染色作用

PI 不能透過活細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞的完整細(xì)胞膜，但能透過晚期凋亡和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜，與細(xì)胞核中的 DNA 結(jié)合，使細(xì)胞核染色。通過 Annexin V-FITC 和 PI 的聯(lián)合染色，可以區(qū)分活細(xì)胞（Annexin V-FITC-/PI-）、早期凋亡細(xì)胞（Annexin V-FITC+/PI-）、晚期凋亡細(xì)胞（Annexin V-FITC+/PI+）和壞死細(xì)胞（Annexin V-FITC-/PI+）。

檢測方法

流式細(xì)胞術(shù)

流式細(xì)胞術(shù)是目前常用的細(xì)胞凋亡檢測方法之一，具有快速、靈敏、定量分析等優(yōu)點。通過設(shè)置未染色組、PI 單染組及 Annexin V-FITC 單染組等對照，調(diào)整流式細(xì)胞儀的電壓和光補償后，可準(zhǔn)確區(qū)分不同狀態(tài)的細(xì)胞。Annexin V-FITC 的最大激發(fā)波長為 488nm，發(fā)射波長為 525nm，在 FL1 通道檢測；PI-DNA 的最大激發(fā)波長為 535nm，發(fā)射波長為 617nm，在 FL2 或 FL3 通道檢測。

熒光顯微鏡檢測

對于懸浮細(xì)胞，可按照流式細(xì)胞術(shù)步驟操作后，將細(xì)胞懸液置于玻片上進(jìn)行觀察。對于貼壁細(xì)胞，可在孔板中放置細(xì)胞爬片，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行誘導(dǎo)凋亡、染色等操作，再用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。在熒光顯微鏡下，早期凋亡細(xì)胞呈綠色熒光，壞死細(xì)胞呈紅色熒光。