在臨床診斷與生命科學(xué)研究領(lǐng)域,乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)是一項(xiàng)具有價(jià)值的指標(biāo)。精準(zhǔn)規(guī)范的檢測(cè)操作流程,是獲取可靠檢測(cè)數(shù)據(jù)的關(guān)鍵前提。
血液是 LDH 檢測(cè)常見(jiàn)樣本類型。采集時(shí),需采用干燥、無(wú)添加劑的專用采血管,采血量一般控制在 3 - 5ml。采血后,應(yīng)輕輕顛倒采血管 8 - 10 次,確保血液與抗凝劑充分混勻,防止血液凝固。對(duì)于血清樣本,需在室溫下靜置 30 分鐘,待血液凝固后再進(jìn)行離心。離心轉(zhuǎn)速設(shè)置為 3000rpm,持續(xù)離心 10 分鐘,此參數(shù)是經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證得出的條件,既能有效分離出血清,又可避免細(xì)胞破損釋放過(guò)多 LDH 造成檢測(cè)結(jié)果偏高。離心后的血清應(yīng)盡快進(jìn)行檢測(cè),若不能及時(shí)檢測(cè),需放置于 2 - 8℃冰箱中保存,但保存時(shí)間不宜超過(guò) 24 小時(shí)。
LDH 檢測(cè)試劑盒在使用前需提前 30 分鐘從冰箱取出,放置至室溫平衡。試劑平衡至室溫的過(guò)程,猶如喚醒沉睡的檢測(cè)系統(tǒng),各組分活性逐漸恢復(fù)至最佳狀態(tài)。加樣時(shí),移液器需精準(zhǔn)校準(zhǔn),誤差控制在 ±2% 以內(nèi)。吸取樣本時(shí),移液器槍頭應(yīng)垂直插入樣本液面下 2 - 3mm 處,避免產(chǎn)生氣泡。加樣量根據(jù)試劑盒說(shuō)明書要求,一般在 20 - 50μl 之間。加樣動(dòng)作需輕柔而準(zhǔn)確,加樣后輕輕晃動(dòng)反應(yīng)板,使樣本與試劑充分混合,但晃動(dòng)幅度不宜過(guò)大,以防液體濺出。
當(dāng)樣本與試劑混合均勻后,酶反應(yīng)即刻啟動(dòng)。LDH 在催化反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用,將乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸,同時(shí)伴隨著 NAD+ 還原為 NADH。這個(gè)過(guò)程對(duì)溫度極為敏感,37℃是最適反應(yīng)溫度。實(shí)驗(yàn)室常用水浴孵箱或酶標(biāo)儀自帶孵育功能進(jìn)行溫控。孵育時(shí)間一般設(shè)定為 15 - 30 分鐘,時(shí)間過(guò)短,反應(yīng)不充分,吸光度值偏低;時(shí)間過(guò)長(zhǎng),可能導(dǎo)致反應(yīng)體系中底物耗盡,酶活性下降,同樣影響檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性。
孵育完成后,使用酶標(biāo)儀在 340nm 波長(zhǎng)下讀取吸光度值。340nm 是 NADH 特征吸收峰,吸光度值與樣本中 LDH 活性呈正相關(guān)。讀取時(shí),酶標(biāo)儀需預(yù)熱 30 分鐘,光路系統(tǒng)需保持清潔,避免灰塵或液體殘留干擾光信號(hào)傳輸。結(jié)果分析時(shí),依據(jù)試劑盒提供的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進(jìn)行計(jì)算。標(biāo)準(zhǔn)曲線需定期重新繪制,以驗(yàn)證試劑盒性能穩(wěn)定性。若檢測(cè)結(jié)果超出標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍,需對(duì)樣本進(jìn)行適當(dāng)稀釋后重新檢測(cè)。
每次檢測(cè)都應(yīng)同步檢測(cè)低、中、高三個(gè)濃度的質(zhì)控品。質(zhì)控品猶如檢測(cè)系統(tǒng)的 “標(biāo)尺",其結(jié)果可反映整個(gè)檢測(cè)流程的準(zhǔn)確性與精密度。低濃度質(zhì)控品結(jié)果波動(dòng)范圍應(yīng)控制在 ±10% 以內(nèi),中、高濃度控制在 ±8% 以內(nèi)。若質(zhì)控結(jié)果偏離此范圍,需立即排查問(wèn)題,可能是試劑配制錯(cuò)誤、儀器校準(zhǔn)偏差或操作步驟失誤等。只有質(zhì)控合格的檢測(cè)結(jié)果,才具有臨床參考價(jià)值。
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