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納米顆粒跟蹤分析(NTA):外泌體表征的重要技術(shù)手段

時(shí)間:2025/6/23閱讀:236
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納米顆粒跟蹤分析(NTA)技術(shù)

外泌體表征重要技術(shù)手段

一、外泌體簡介

在復(fù)雜的生物系統(tǒng)中,細(xì)胞間的信息傳遞與物質(zhì)交換及功能表達(dá)均依賴于一類特殊的載體——外泌體。

外泌體作為細(xì)胞外囊泡中重要的亞群,是直徑約 30-150 納米的膜性囊泡,其內(nèi)部攜載著蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等生物活性分子,在細(xì)胞間通訊網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵作用(圖1)。研究表明,腫瘤細(xì)胞來源的外泌體可通過促進(jìn)血管生成、誘導(dǎo)免疫抑制微環(huán)境等途徑支持腫瘤進(jìn)展;神經(jīng)元分泌的外泌體則參與神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)控及突觸可塑性維持。這些研究的實(shí)現(xiàn),均依賴于對(duì)外泌體物理特性(如粒徑分布、濃度水平)的精準(zhǔn)解析。

而納米顆粒跟蹤分析(NTA)技術(shù)作為解析外泌體粒徑與濃度等基本物理特性最為常用的技術(shù)手段之一,對(duì)外泌體相關(guān)的科研及醫(yī)療研究發(fā)揮著不可或缺的重要作用。

納米顆粒跟蹤分析(NTA):外泌體表征的重要技術(shù)手段 

1  外泌體的潛在應(yīng)用

、納米顆粒跟蹤分析(NTA)技術(shù)

1、NTA核心工作原理

納米顆粒跟蹤分析技術(shù)(NTA)基于光散射理論與布朗運(yùn)動(dòng)分析的有機(jī)結(jié)合,實(shí)現(xiàn)對(duì)外泌體等納米顆粒的精準(zhǔn)表征。其核心構(gòu)成技術(shù)原理如下(圖2)

納米顆粒跟蹤分析(NTA):外泌體表征的重要技術(shù)手段 

2  NTA核心結(jié)構(gòu)

納米顆粒跟蹤分析技術(shù)(NTA)通過激光散射光路系統(tǒng),對(duì)溶液中的納米級(jí)顆粒進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測。當(dāng)單束激光聚焦于樣品池時(shí),顆粒的散射光信號(hào)被高靈敏度相機(jī)捕捉,形成實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)圖像?;?/span>Stokes-Einstein方程(圖3),通過追蹤單個(gè)顆粒的運(yùn)動(dòng)軌跡并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,可精確計(jì)算顆粒的流體力學(xué)直徑及濃度分布。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì) 10-1000 納米粒徑范圍顆粒的單顆粒分辨率檢測,尤其適用于異質(zhì)性外泌體群體的表征。

納米顆粒跟蹤分析(NTA):外泌體表征的重要技術(shù)手段 

3  Stokes-Einstein方程

2、NTA技術(shù)特點(diǎn)

·       高分辨率檢測:可識(shí)別 10 納米級(jí)粒徑差異。

·       高效率檢測相比傳統(tǒng)檢測技術(shù),NTA 顯著縮短檢測周期,從樣本加載到完成分析僅需 5 分鐘,較透射電子顯微鏡(TEM)的 2 小時(shí)以上前處理時(shí)間,效率大幅提升

·       可視化數(shù)據(jù)呈現(xiàn):通過保存顆粒運(yùn)動(dòng)的實(shí)時(shí)影像及散射光強(qiáng)度圖譜,實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的可視化驗(yàn)證,為數(shù)據(jù)可靠性提供直觀依據(jù)。

·       多場景應(yīng)用:除了顆粒粒徑、濃度等基本功能外,NTA還能集成熒光模塊和ZETA電位模塊,實(shí)現(xiàn)標(biāo)記樣本檢測和樣本顆粒表面電位檢測的應(yīng)用能力。

3、NTA其他外泌體表征技術(shù)的對(duì)比優(yōu)勢

外泌體的精準(zhǔn)表征是開展基礎(chǔ)研究與臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵前提。作為納米級(jí)囊泡檢測的核心技術(shù),納米顆粒跟蹤分析(NTA)在與其他表征手段的對(duì)比中展現(xiàn)出不可替代的優(yōu)勢。

由于技術(shù)原理的限制,其他表征手段存在著一些缺陷:TEM技術(shù)檢測流程復(fù)雜,程耗時(shí)長( 4 小時(shí)以上),且僅能獲取局部顆粒信息,人工計(jì)數(shù)誤差率高 15%-20%,難以反映樣本整體分布特征;DLS技術(shù)在多分散體系檢測領(lǐng)域表現(xiàn)不佳,且易產(chǎn)生粒徑分布偏移誤差、在低豐度樣本檢測中誤差顯著增大;流式細(xì)胞術(shù)需對(duì)目標(biāo)顆粒進(jìn)行熒光標(biāo)記以實(shí)現(xiàn)檢測,標(biāo)記過程可能改變外泌體天然屬性,且僅能提供單一熒光參數(shù)分析。

NTA 技術(shù)憑借其在精準(zhǔn)高效、動(dòng)態(tài)檢測、無標(biāo)記分析及可視化驗(yàn)證方面的獨(dú)特優(yōu)勢和對(duì)多分散體系檢測的優(yōu)良表現(xiàn)顯著彌補(bǔ)了傳統(tǒng)外泌體表征技術(shù)的局限性。并且,由于NTA對(duì)外泌體檢測沒有任何預(yù)處理要求,即直接對(duì)提取的原生態(tài)外泌體樣本(最接近生理?xiàng)l件)進(jìn)行檢測,使得NTA能夠精準(zhǔn)刻畫外泌體的物理化學(xué)特性,為深入探索外泌體功能機(jī)制提供可靠的數(shù)據(jù)支撐。其在不同應(yīng)用場景下展現(xiàn)出的精準(zhǔn)性與高效性,為后續(xù)在外泌體研究各領(lǐng)域的深入應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

基于此,NTA技術(shù)已經(jīng)是外泌體研究不可或缺的一種重要分析手段,以下將通過具體應(yīng)用案例,進(jìn)一步展現(xiàn)其在實(shí)際研究與臨床實(shí)踐中的重要價(jià)值。

、NTA在外泌體研究中的應(yīng)用案例分析

1、NTA精準(zhǔn)檢測外泌體囊泡的粒徑濃度

納米顆粒跟蹤分析(NTA):外泌體表征的重要技術(shù)手段 

4  案例文獻(xiàn)1

《Nanoparticle tracking analysis monitors microvesicle and exosome secretion from immune cells》研究中(圖4,NTA 被用于監(jiān)測免疫細(xì)胞(如 Jurkat T 細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞)在刺激(離子載體、LPS)或抑制(基因敲低、分泌抑制劑)條件下的 EVs 分泌動(dòng)態(tài)。NTA 可動(dòng)態(tài)追蹤 EVs 濃度變化,如離子載體刺激使 Jurkat T 細(xì)胞 EVs 濃度增加 43%-126%,LPS 激活樹突狀細(xì)胞后 EVs 分泌 48 小時(shí)達(dá)峰值;通過粒徑分布區(qū)分微囊泡(100-1000 nm)與外泌體(30-150 nm),發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞分泌的 EVs 以 70-90 nm 為主(圖5;結(jié)合抗 CD45 免疫磁珠去除 T 細(xì)胞來源 EVs,NTA 信號(hào)減少 60%,驗(yàn)證檢測特異性。該技術(shù)為免疫細(xì)胞 EVs 分泌與激活狀態(tài)的關(guān)聯(lián)研究提供了精準(zhǔn)的定量工具。

納米顆粒跟蹤分析(NTA):外泌體表征的重要技術(shù)手段 

5  該案例研究中,NTA測得的外泌體粒徑與濃度

該研究證明,納米顆粒跟蹤分析(NTA)技術(shù)通過單顆粒實(shí)時(shí)追蹤,能對(duì)細(xì)胞 EVs實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)的粒徑與濃度表征, 為EVs相關(guān)的各學(xué)科科研工作、及EVs檢測作為技術(shù)手段的臨床醫(yī)療研究提供強(qiáng)有力的技術(shù)支持。

2、NTA技術(shù)為再生醫(yī)學(xué)科研提供重要助力

納米顆粒跟蹤分析(NTA):外泌體表征的重要技術(shù)手段 

6  案例文獻(xiàn)2

在比較 FBS 與 HPL 培養(yǎng)的 MSC-EVs 研究中(圖6,NTA 作為核心表征工具:測定 F-EVs 與 H-EVs 粒徑均約 150 nm,量化 H-EVs 顆粒濃度較 F-EVs 高 1.5 倍,證實(shí) HPL 促進(jìn) EVs 分泌;通過顆粒數(shù) / 蛋白質(zhì)量比驗(yàn)證兩者純度均超 1×10? particles/μg,符合臨床級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(圖7;在體外血管生成和體內(nèi)腎損傷模型中,基于 NTA 濃度數(shù)據(jù)實(shí)現(xiàn) EVs 給藥劑量的標(biāo)準(zhǔn)化控制。NTA 通過精準(zhǔn)量化 EVs 物理特性,為無動(dòng)物源培養(yǎng)基篩選、EVs 產(chǎn)量評(píng)估及功能實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化提供數(shù)據(jù)支撐,推動(dòng) MSC-EVs 在再生醫(yī)學(xué)中的機(jī)制研究與轉(zhuǎn)化應(yīng)用。

納米顆粒跟蹤分析(NTA):外泌體表征的重要技術(shù)手段 

7  不同通路的充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)及其來源細(xì)胞外囊泡(MSC-EVs)的特性分析

該研究證實(shí),NTA技術(shù)通過精準(zhǔn)量化外泌體的物理特性,為間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體的研究提供了核心數(shù)據(jù)支撐,其單顆粒追蹤特性為解析 EVs 分泌動(dòng)力學(xué)(如缺氧或藥物刺激下的釋放規(guī)律)提供了量化依據(jù),推動(dòng) EVs 在再生醫(yī)學(xué)中的機(jī)制研究與標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)化,成為連接基礎(chǔ)科研與臨床應(yīng)用的關(guān)鍵技術(shù)橋梁。

3NTA技術(shù)為臨床醫(yī)療策略和療效評(píng)估提供關(guān)鍵數(shù)據(jù)支撐

納米顆粒跟蹤分析(NTA):外泌體表征的重要技術(shù)手段 

8  案例文獻(xiàn)3

《Enhancing immunogenicity and release of in situ-generated tumor vesicles for autologous vaccines》研究中(圖8,NTA 用于評(píng)估 Combo-NPs@shGNE 納米顆粒原位疫苗策略:檢測到該策略使 TEV 釋放率提升至 56.44%(較空白組高 9.57 倍),TEV 濃度達(dá) 1.2×10? particles/10? cells,粒徑分布更集中;體內(nèi)腫瘤組織中,NTA 顯示治療組 TEV 顆粒數(shù)較空白組提升 1.32 倍,且與 HSP70 等免疫刺激分子含量正相關(guān);TEV 濃度數(shù)據(jù)直接關(guān)聯(lián)腫瘤生長抑制率,成為評(píng)估疫苗效果的關(guān)鍵參數(shù)(圖9。NTA 通過量化 TEV 粒徑、濃度及釋放效率,為原位疫苗的機(jī)制驗(yàn)證與療效評(píng)估提供了核心技術(shù)支撐。

納米顆粒跟蹤分析(NTA):外泌體表征的重要技術(shù)手段 

9  NTA測定 TEV 的粒徑分布和粒子數(shù)

在該研究證明,納米顆粒跟蹤分析(NTA)技術(shù)完全能夠作為驗(yàn)證研究假設(shè)和評(píng)估治療效果的核心工具,用于細(xì)胞外囊泡(包括外泌體)的粒徑分布、顆粒濃度及釋放效率的定量表征,發(fā)揮至關(guān)重要的作用

、總結(jié)

納米顆粒跟蹤分析(NTA技術(shù)憑借其高分辨率、快速檢測和可視化驗(yàn)證等優(yōu)勢和對(duì)多分散體系檢測的優(yōu)良表現(xiàn),在外泌體相關(guān)各領(lǐng)域研究中發(fā)揮著不可或缺的重要作用:在基礎(chǔ)研究中,其通過解析外泌體的粒徑分布與濃度特征,助力揭示外泌體在細(xì)胞間通訊中的作用機(jī)制,如腫瘤細(xì)胞外泌體促血管生成、神經(jīng)元外泌體調(diào)控神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)等過程;在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,NTA 為間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體(MSC-EVs)的培養(yǎng)基篩選、產(chǎn)量評(píng)估及質(zhì)量控制提供核心支撐,推動(dòng)無動(dòng)物源培養(yǎng)基的臨床轉(zhuǎn)化;在臨床治療策略開發(fā)中,可用于監(jiān)測腫瘤原位疫苗誘導(dǎo)的囊泡釋放效率、評(píng)估免疫原性囊泡的粒徑均一性,為個(gè)性化疫苗優(yōu)化提供量化依據(jù);在疾病診斷與療效監(jiān)測方面,NTA 通過動(dòng)態(tài)追蹤血液、尿液等樣本中外泌體的物理特性變化,為腫瘤早期篩查、病程進(jìn)展判斷及治療響應(yīng)評(píng)估提供技術(shù)支持;此外,在藥物遞送系統(tǒng)研究中,NTA 可實(shí)時(shí)監(jiān)測外泌體載藥前后的粒徑變化與濃度波動(dòng),輔助優(yōu)化載藥工藝并確保給藥劑量標(biāo)準(zhǔn)化,全面推動(dòng)外泌體在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用。

NTA已成為外泌體研究的不可替代的工具。未來,隨著技術(shù)的不斷創(chuàng)新,NTA 將進(jìn)一步推動(dòng)外泌體的基礎(chǔ)研究與臨床轉(zhuǎn)化相關(guān)的生物生命科學(xué)研究、各類疾病診斷和治療中發(fā)揮更大作用。

 

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