在生物化學(xué)與細(xì)胞分析領(lǐng)域，非蛋白質(zhì)巰基（Non-protein Sulfhydryl，NPSH）含量測(cè)定是評(píng)估細(xì)胞氧化還原狀態(tài)、藥物毒性以及疾病診斷的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。其操作規(guī)范性與準(zhǔn)確性對(duì)于科研成果的可靠性以及臨床診斷的精準(zhǔn)性具有決定性意義。

非蛋白質(zhì)巰基基本概念與生物學(xué)意義

非蛋白質(zhì)巰基主要指細(xì)胞內(nèi)除蛋白質(zhì)巰基之外的游離巰基，包括谷胱甘肽（GSH）、半胱氨酸（Cys）等小分子巰基化合物。這些物質(zhì)在維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡、抵御氧化應(yīng)激損傷、參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及解毒過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。例如，在肝臟細(xì)胞中，GSH 占非蛋白質(zhì)巰基總量的 85% - 90%，它通過(guò)與自由基反應(yīng)，清除活性氧（ROS）與活性氮（RNS），保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷；在胰島 β 細(xì)胞中，Cys 作為胰島素合成過(guò)程中的重要巰基供體，其濃度變化直接影響胰島素二硫鍵正確形成與分泌，非蛋白質(zhì)巰基濃度異常降低常與 2 型糖尿病胰島素抵抗及 β 細(xì)胞功能障礙密切相關(guān)。

非蛋白質(zhì)巰基測(cè)定工作原理與方法選擇

巰基特異性顯色反應(yīng)原理

非蛋白質(zhì)巰基測(cè)定基于巰基與特定試劑發(fā)生氧化還原或絡(luò)合反應(yīng)產(chǎn)生可定量檢測(cè)的顯色或熒光產(chǎn)物。常用試劑 5,5' - 二硫代雙 (2 - 硝基苯甲酸)（DTNB）與巰基定量反應(yīng)生成 5 - 硝基 - 2 - 硫代苯甲酸（TNB - ），TNB - 在 412nm 處具有特征吸收峰，其吸光度值與樣本中非蛋白質(zhì)巰基濃度呈正比關(guān)系。反應(yīng)方程式為：DTNB + SH → TNB - + S - S，摩爾消光系數(shù)為 13600 L·mol?1·cm?1，檢測(cè)靈敏度可達(dá) 0.1 - 1μmol/L。此方法操作簡(jiǎn)便、成本較低，適用于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室批量樣本檢測(cè)，但易受樣本中其他還原性物質(zhì)（如維生素 C、尿酸等）干擾，需通過(guò)預(yù)處理去除干擾物質(zhì)。

熒光標(biāo)記與檢測(cè)原理

新型熒光探針（如 Monobromobimane，MB）與巰基反應(yīng)生成強(qiáng)熒光產(chǎn)物（熒光激發(fā)波長(zhǎng) 380 - 400nm，發(fā)射波長(zhǎng) 460 - 490nm），熒光強(qiáng)度與非蛋白質(zhì)巰基濃度在 0 - 10μmol/L 范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（線性相關(guān)系數(shù) R2 ≥ 0.99）。熒光檢測(cè)方法具有高靈敏度、高特異性優(yōu)點(diǎn)，可檢測(cè)低至納摩爾級(jí)別非蛋白質(zhì)巰基濃度，特別適用于微量樣本（如單細(xì)胞、組織切片）分析，但儀器成本較高、操作相對(duì)復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境要求嚴(yán)格（需避光操作，防止熒光淬滅）。

非蛋白質(zhì)巰基測(cè)定操作步驟與要點(diǎn)

樣本采集與前處理

對(duì)于細(xì)胞樣本，收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用預(yù)冷 PBS 洗滌 2 - 3 次，離心去除培養(yǎng)基與PBS，加入裂解液（含蛋白酶抑制劑與磷酸酶抑制劑，防止蛋白降解與去磷酸化干擾測(cè)定）按 106 個(gè)細(xì)胞 / mL 比例裂解，冰上孵育 15 - 30 分鐘，4℃ 12000rpm 離心 10 分鐘取上清，即為非蛋白質(zhì)巰基提取液。動(dòng)物組織樣本需精確稱取 0.1 - 0.2g 組織，用組織研磨器在液氮環(huán)境下研磨成細(xì)粉，加入 1mL 裂解液，冰浴超聲破碎（功率 200W，超聲 3 秒，間隔 5 秒，重復(fù) 10 次），4℃ 12000rpm 離心 15 分鐘取上清。血漿樣本直接離心（3000rpm，10 分鐘，4℃）取上清，所有樣本提取液分裝于EP管，-80℃保存，避免反復(fù)凍融。

測(cè)定步驟與條件控制

以 DTNB 法為例，取 100μL 樣本提取液于 96 孔板，加入 100μL 0.3mmol/L DTNB 溶液（用 0.1mol/L 磷酸鹽緩沖液，pH 7.4 配制，現(xiàn)用現(xiàn)配），混勻后室溫避光反應(yīng) 10 分鐘，用酶標(biāo)儀在 412nm 波長(zhǎng)測(cè)定吸光度值。每個(gè)樣本設(shè)置 3 個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)置試劑空白對(duì)照（以樣本提取液替換 DTNB 溶液）。熒光法操作中，取 50μL 樣本提取液于 384 孔黑板，加入 50μL 50μmol/L MB 溶液（用 DMSO 配制，終濃度 25μmol/L），37℃避光反應(yīng) 30 分鐘，用熒光酶標(biāo)儀在 Ex/Em=380/460nm 測(cè)定熒光強(qiáng)度。兩種方法均需提前制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用 GSH 標(biāo)準(zhǔn)品（濃度范圍 0 - 50μmol/L）按相同步驟測(cè)定，繪制吸光度值或熒光強(qiáng)度與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本非蛋白質(zhì)巰基濃度。

非蛋白質(zhì)巰基測(cè)定質(zhì)量控制與結(jié)果分析

質(zhì)量控制措施

每日檢測(cè)前需測(cè)定質(zhì)控樣本（低、中、高三個(gè)濃度水平），其測(cè)定值應(yīng)落入靶值 ±15% 范圍內(nèi)。質(zhì)控樣本可采用商業(yè)化的非蛋白質(zhì)巰基定值血清或自制質(zhì)控樣本（將已知濃度 GSH 溶液與正常血漿或細(xì)胞提取液混合制備）。每 20 個(gè)樣本檢測(cè)插入一個(gè)重復(fù)質(zhì)控樣本，監(jiān)控檢測(cè)過(guò)程穩(wěn)定性。定期參加外部質(zhì)量評(píng)價(jià)計(jì)劃（如英國(guó)生物學(xué)會(huì) RSB 非蛋白質(zhì)巰基檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)），確保實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果與國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)一致。

結(jié)果分析與臨床意義解讀

非蛋白質(zhì)巰基濃度在不同組織與細(xì)胞類型差異顯著，如肝臟細(xì)胞非蛋白質(zhì)巰基含量高達(dá) 5 - 10mmol/kg 蛋白質(zhì)，而紅細(xì)胞內(nèi)濃度約為 1 - 2mmol/g 血紅蛋白。在氧化應(yīng)激相關(guān)疾?。ㄈ绺尾　⒛I病、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病）中，非蛋白質(zhì)巰基濃度普遍降低 30% - 70%，其下降程度與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。例如，在急性肝炎患者血清中，非蛋白質(zhì)巰基濃度可從正常值 0.8 - 1.2mmol/L 降至 0.3 - 0.5mmol/L，同時(shí)轉(zhuǎn)氨酶顯著升高；在 2 型糖尿病患者胰島細(xì)胞中，非蛋白質(zhì)巰基減少導(dǎo)致胰島素合成障礙，空腹血糖與糖化血紅蛋白水平升高。動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)非蛋白質(zhì)巰基濃度變化可評(píng)估疾病進(jìn)展與治療效果，如肝硬化患者經(jīng)保肝治療后，非蛋白質(zhì)巰基濃度逐漸回升，與肝功能指標(biāo)（白蛋白、凝血酶原時(shí)間）改善同步發(fā)生。

非蛋白質(zhì)巰基測(cè)定技術(shù)優(yōu)化與常見(jiàn)問(wèn)題解決

提高檢測(cè)靈敏度與特異性的方法

為降低樣本中維生素 C、尿酸等還原性物質(zhì)干擾，可在樣本提取液中加入適量 N - 乙基順烏頭酸鹽（NEAA，終濃度 1mmol/L），此試劑可特異性抑制維生素 C 氧化還原酶活性，消除維生素 C 干擾。對(duì)于復(fù)雜生物樣本（如血漿、組織勻漿），采用固相萃取（SPE）技術(shù)預(yù)處理，用親水性 C18 柱吸附非蛋白質(zhì)巰基，洗脫后測(cè)定，可提高檢測(cè)靈敏度 2 - 5 倍。優(yōu)化反應(yīng)條件，如將 DTNB 法反應(yīng)溫度提高至 37℃，反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)至 15 分鐘，可使檢測(cè)下限降至 0.05μmol/L；熒光法中，將反應(yīng) pH 調(diào)整至 7.8 - 8.0，MB 濃度優(yōu)化為 30μmol/L，可增強(qiáng)熒光信號(hào)強(qiáng)度 30% - 40%。

儀器校準(zhǔn)與維護(hù)要點(diǎn)

酶標(biāo)儀需每月使用標(biāo)準(zhǔn)濾光片校準(zhǔn)波長(zhǎng)準(zhǔn)確性（誤差＜±1nm），每季度檢查光路系統(tǒng)，確保光強(qiáng)穩(wěn)定性（波動(dòng)＜±2%）。熒光酶標(biāo)儀除波長(zhǎng)校準(zhǔn)外，還需定期校準(zhǔn)熒光強(qiáng)度（使用熒光標(biāo)準(zhǔn)品，如熒光素鈉溶液），校準(zhǔn)頻率為每月一次。儀器使用完畢后，立即用蒸餾水沖洗比色皿或微孔板，防止殘留試劑結(jié)晶損壞儀器。對(duì)于長(zhǎng)期不用的儀器，每月至少開(kāi)機(jī)運(yùn)行 30 分鐘，進(jìn)行自檢與預(yù)熱，延長(zhǎng)儀器使用壽命。