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3T3-L1細胞培養(yǎng)基的核心配方為DMEM高糖培養(yǎng)基，需添加10%胎牛血清(FBS)或小牛血清(CS)及1%青霉素-鏈霉素(P/S)，培養(yǎng)條件為37℃、5% CO?恒溫培養(yǎng)箱。
3T3-L1細胞培養(yǎng)基具體說明：
一、基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分
DMEM高糖培養(yǎng)基
核心成分：含葡萄糖(4.5g/L)、氨基酸、維生素及無機鹽，為細胞提供基礎(chǔ)營養(yǎng)。
NaHCO?緩沖系統(tǒng)：維持培養(yǎng)基pH穩(wěn)定(通常含1.5g/L NaHCO?)，需配合5% CO?環(huán)境使用。
血清補充
胎牛血清(FBS)或小牛血清(CS)：
濃度：10%(常規(guī)培養(yǎng))或2%(誘導前預處理，用于降低血清依賴性)。
作用：提供生長因子、激素及貼壁因子，促進細胞增殖與分化。
替代方案：若需標準化實驗，可使用化學成分明確的培養(yǎng)基(如Serum-Free Media)，但需額外補充脂質(zhì)、轉(zhuǎn)鐵蛋白等成分。
抗生素
青霉素-鏈霉素(P/S)：
濃度：1%(100U/mL青霉素+100μg/mL鏈霉素)。
作用：預防細菌污染，但需注意長期使用可能影響細胞代謝。
其他添加劑
GlutaMAX-1谷氨酰胺：替代L-谷氨酰胺，穩(wěn)定性更高，減少氨毒性。
MEM NEAA非必需氨基酸：補充非必需氨基酸，支持細胞快速增殖。
Sodium Pyruvate丙酮酸鈉：作為能量補充劑，增強細胞代謝活性。
二、培養(yǎng)條件優(yōu)化
環(huán)境控制
溫度：37℃(恒溫培養(yǎng)箱)。
氣體：95%空氣+5% CO?(維持pH穩(wěn)定)。
濕度：70%-80%(防止培養(yǎng)基蒸發(fā))。
細胞密度管理
傳代時機：匯合度達70%-80%時傳代，避免過度融合導致分化抑制。
接種密度：對數(shù)生長期細胞按2.0×10? cells/cm²接種，確保均勻生長。
傳代操作
消化液：0.25% Trypsin-EDTA，消化1-2分鐘(顯微鏡下觀察細胞變圓后終止)。
離心條件：1000rpm×5min，去除消化液及代謝廢物。
鋪板均勻性：傳代時輕柔吹打，避免細胞團塊形成，確保分化一致性。
三、成脂誘導分化培養(yǎng)基
誘導階段
接觸抑制：細胞長滿至100%融合后，靜置2天使細胞進入生長停滯期。
誘導液A：DMEM+10% FBS+0.5mM IBMX+1μM DEX+10μg/mL胰島素，培養(yǎng)2天。
誘導液B：DMEM+10% FBS+10μg/mL胰島素，培養(yǎng)4-6天(每2天換液一次)。
關(guān)鍵成分作用
IBMX：磷酸二酯酶抑制劑，提高細胞內(nèi)cAMP水平，激活PKA通路。
DEX：糖皮質(zhì)激素，誘導C/EBPβ表達，啟動成脂程序。
胰島素：促進葡萄糖攝取與脂質(zhì)合成，維持分化后細胞功能。
分化成功標志
形態(tài)學：細胞變圓，形成脂滴(油紅O染色呈紅色或橘紅色)。
分子標志：PPARγ、C/EBPα、FABP4等基因表達上調(diào)。
四、質(zhì)量控制與注意事項
無菌操作
培養(yǎng)基配制時需嚴格無菌，誘導劑分裝后-20℃保存，避免反復凍融。
細胞操作全程在超凈工作臺內(nèi)完成，使用前紫外線照射30分鐘。
細胞狀態(tài)監(jiān)測
定期觀察：顯微鏡下檢查細胞形態(tài)、貼壁情況及污染跡象。
生長曲線繪制：通過MTT法或細胞計數(shù)儀監(jiān)測增殖速率，優(yōu)化傳代周期。
常見問題解決
貼壁差：使用0.1%明膠包被培養(yǎng)底面，或增加血清濃度至15%。
誘導效率低：檢查細胞代數(shù)(建議使用P5-P15代細胞)，或增加DEX濃度至2μM。
污染處理：立即丟棄污染細胞，消毒培養(yǎng)箱及超凈工作臺。
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