DNase I揭秘：用于DNA操作研究的強(qiáng)力工具-賽默飛

DNase I是什么酶？

DNase I是一種多功能酶，可以非特異性地切割DNA，產(chǎn)生5'端為磷酸基團(tuán)的二核苷酸、三核苷酸、或寡核苷酸 (1)。它是一種非常強(qiáng)大的DNA操作研究工具，可用于一系列分子生物學(xué)應(yīng)用。

賽默飛提供DNase I溶液，請?jiān)L問獲取產(chǎn)品最新信息。

DNase I酶的功能包括：

1. 提取RNA后降解污染DNA

2. 在RT-PCR前或體外轉(zhuǎn)錄后純化RNA

3. 識別與蛋白結(jié)合的DNA序列（DNase I足跡法）

4. 避免處理培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)細(xì)胞聚集

5. 為DNA序列體外重組反應(yīng)提供片段庫

雖然實(shí)驗(yàn)室會經(jīng)常用到DNase I，但很多研究者仍對DNase I的活性不甚了解。他們可能會有這樣的提問：某種來源的DNase I與另一種的單位是一樣的嗎？鈣離子與鎂離子是保持DNase I活性所必需的嗎？在DNA與RNA雜合鏈中，DNase I會不會降解DNA？DNase I能100%去除RNA樣品中的污染DNA嗎？本文將設(shè)法回答圍繞這一常用酶的一些問題。

更好的單位定義

DNase I的比活性反映的是每單位酶降解雙鏈DNA的能力。以往，比活性通常用庫尼茨單位（Kunitz）表示 (2)，一個庫尼茨單位是指以鮭魚精子DNA為底物，在0.1M NaOAc (pH 5.0) 緩沖液的條件下，使反應(yīng)液每分鐘吸光度增加0.001所需要的酶量。然而這種緩沖液與DNase I消化時(shí)使用的典型緩沖液條件是不一樣的（見右邊的“使用DNase I處理RNA樣品”）。我們則提供了一種更好的DNase I單位定義，該定義能更好地反映標(biāo)準(zhǔn)條件下DNase I所具有的降解DNA的能力。最新的DNase I活性測定程序使用實(shí)時(shí)熒光分析法，可以實(shí)現(xiàn)快速、定量的測量。

消化條件

和許多其他的酶一樣，DNase I活性也會受反應(yīng)緩沖液成分的影響。與人們通常認(rèn)知的不同，DNase I在含有Mg²⁺但不含Ca²⁺的緩沖液中沒有活性 (3)。事實(shí)上，有文獻(xiàn)證據(jù)表明在不含Ca²⁺的緩沖液中DNase I具有少量活性，是由鈣離子污染造成的協(xié)同激活作用引起的。因此，在緩沖液中加入遠(yuǎn)小于Mg²⁺水平、但高于Ca²⁺水平的EGTA，可有效抑制DNase I活性1000倍甚至更多。Ca²⁺可與DNase I緊密結(jié)合，使其活性結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，甚至微摩爾水平的Ca²⁺也可在Mg²⁺存在的情況下有效激活酶的活性反應(yīng)。

反映緩沖液的離子強(qiáng)度也是影響DNase I活性的一個因素。DNase I在緩沖液中含有Mg2+與Ca2+且不含其他鹽的情況下具有最高活性。當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)緩沖液成分的鹽（NaCl或KCl）濃度從0增加到30mM時(shí)，DNase I的活性會降低2倍多 (4)。雖然MAXIscript™、MEGAscript™或其他轉(zhuǎn)錄緩沖液中也含有鹽，但它們的DNA降解效果依然很好，因?yàn)楹羞h(yuǎn)遠(yuǎn)超過降解DNA模板所需的DNase I量。關(guān)于建議的DNase I消化緩沖液信息，請查看側(cè)邊欄的“使用DNase I處理RNA樣品”。

剪切的特異性

DNase I消化非勻質(zhì)dsDNA時(shí)會得到60%的雙核苷酸、25%的三核苷酸和一些寡核苷酸。DNase I最小可消化三個核苷酸的片段。雖然一般認(rèn)為DNase I切割DNA時(shí)是非特異性的剪切，但實(shí)際上它更傾向作用于某些序列片段。例如，DNase I更容易作用于小溝區(qū)，也更傾向于剪切嘌呤-嘧啶序列。然而，DNase I在作用于非勻質(zhì)dsDNA時(shí)會對四種堿基都進(jìn)行剪切，且對于某種特定堿基的作用不會大于其它堿基3倍以上。

賽默飛的技術(shù)服務(wù)部門經(jīng)常會被問到DNase I是只能剪切雙鏈DNA，還是同樣可以降解單鏈DNA (ssDNA) 以及RNA-DNA 雜交中的DNA。DNase I能夠剪切后兩種底物，但活性大大低。例如，DNase I剪切ssDNA的比活性是剪切dsDNA的比活性的約500分之一 (4)，在RNA-DNA雜合鏈中的活性小于作用于dsDNA 時(shí)的活性1-2% (5)。特別要指出的是，在使用DNase I時(shí)，通常使用遠(yuǎn)高于所需的濃度值。例如，實(shí)驗(yàn)顯示，2個單位的DNase I（產(chǎn)品號 AM2222）孵育15分鐘后，可以將1µg的100-mer寡核苷酸降解成小于5-mer的寡核苷酸。因此，切割ssDNA和RNA-DNA雜合鏈的程度會隨著檢測時(shí)的特定條件不同而不同。

去除RNA制備過程中的DNA污染

DNase I較為常見的應(yīng)用是在制備RNA過程中是通過降解殘留的DNA來控制基因組DNA的量（低于10µg/ml），以免其影響后續(xù)的RT-PCR。一次DNase I反應(yīng)所能處理的RNA量取決于DNA污染的程度。進(jìn)行有機(jī)萃取，或使用固相RNA純化方法時(shí)二氧化硅基體過載時(shí)，都可能引入DNA；而從某些組織（例如，脾、腎、胸腺）和或轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中提取的RNA同樣會傾向于存在更高水平的DNA污染。例如，有報(bào)告指出，使用Chomcynsk和Sacchi方法 (6) 提取腫瘤里的RNA會含有7%的DNA，若RNA制備達(dá)到一定規(guī)模時(shí)，DNA的量可以達(dá)到微克水平 (7)。

DNA的去除

要去除RNA樣品中的每一條DNA鏈幾乎是不可能的。RT-PCR可以從復(fù)雜非勻質(zhì)混合物中擴(kuò)增單個分子；事實(shí)上，RT-PCR非常敏感，在進(jìn)行40次以上PCR反應(yīng)循環(huán)后，幾乎每次反應(yīng)都會在無逆轉(zhuǎn)錄對照反應(yīng)中產(chǎn)生擴(kuò)增條帶，表明存在DNA污染。因此，選擇DNase I消化條件以及合理的RT-PCR循環(huán)數(shù)非常重要。為了降解DNA，應(yīng)使用側(cè)邊欄“使用DNase I處理RNA樣品”中所述的緩沖液。此外，不要在RNA濃度過高時(shí)進(jìn)行消化處理。應(yīng)先將RNA樣品稀釋到~100 µg/ml以內(nèi)后再進(jìn)行處理。DNase I的用量取決于污染的程度。（相關(guān)指示請同樣參考側(cè)邊欄說明）。

不要浪費(fèi)DNase！

DNase I是一種粘性酶。添加DNase后十分鐘內(nèi)，我們在某些微量離心管和96孔板上檢測到的DNase活性達(dá)到所添加的DNase的活性的一半。為了得到更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可使用賽默飛的無粘性不含RNase的微量離心管（產(chǎn)品號12450）用于DNase I消化。

反應(yīng)后DNase I的去除

‘DNase I處理比較簡單，難的是反應(yīng)后DNase I的去除，而且如果反應(yīng)后的RNA 是用來合成cDNA的話，去除DNase I就變得更為關(guān)鍵。雖然可用苯酚萃取法去除DNase I，但許多研究人員都避免使用這種方法，因?yàn)樗麄儞?dān)心萃取過程中可能會丟失珍貴的RNA樣品，而且苯酚萃取法耗時(shí)，苯酚本身是有毒化學(xué)品，另外即使很少的苯酚殘留也會對cDNA合成產(chǎn)生抑制效果。許多研究人員采用在75攝氏度下加熱十分鐘的方法使DNase I失活，然而這種方法也會造成RNA 樣品的損壞，因?yàn)樵诤卸r(jià)陽離子的DNase消化緩沖液中，進(jìn)行加熱時(shí)可能造成RNA非酶促降解。DNA-free™（產(chǎn)品號1906）不僅含有DNase I和優(yōu)化的DNase I緩沖液，還包含一種新穎的DNase去除試劑。該DNase去除試劑在消化完成后加入反應(yīng)體系時(shí)，會與DNase I結(jié)合且螯合陽離子，在數(shù)分鐘內(nèi)使DNase失活。只需離心去除DNase去除試劑生成的沉淀，就可繼續(xù)后面的試驗(yàn)了。

截取自Ambion的技術(shù)說明稿8:4，© 2001

使用DNase I處理RNA樣品：本方法可有效除去25-100ul RNA樣品中最多1µg的DNA雜質(zhì)。我們建議25-100ul反應(yīng)體系中每10µg以內(nèi)的RNA樣品添加2個單位的DNase I*。DNase I緩沖液的配方見下文。如果處理多于10µg的RNA樣品，或RNA樣品被DNA嚴(yán)重污染 (>10 µg/ml)，應(yīng)先稀釋RNA 樣品（如下所示），然后按比例決定反應(yīng)需要量。對于嚴(yán)重污染的RNA樣品，在使用DNase I處理前將核酸濃度稀釋到100µg/ml，然后加入2~3ul（4~6個單位）的DNase I，在37°C下孵育1小時(shí)。

10倍的DNase I緩沖液

100 mM Tris pH 7.5

25 mM MgCl2

5 mM CaCl2

* 一個單位的DNase I的定義為：在37°C溫度下，10分鐘降解1µg DNA 所需要的DNase I量。

Thermo Scientific DNase I 可去除細(xì)胞裂解物中不需要的 DNA，以改善蛋白提取效率。

Thermo Scientific DNase I 的特點(diǎn)：

•降解并去除樣品中不需要的 DNA

•裂解單鏈和雙鏈 DNA

•與 Thermo Scientific Pierce 細(xì)胞裂解試劑兼容

•減少細(xì)菌裂解物（蛋白提取物）的粘性以方便移取

脫氧核糖核酸酶 I (DNase I) 是一種單一糖基化多肽，能夠降解不需要的單鏈和雙鏈 DNA。該酶將 DNA 切割為 5'磷酸二核苷酸及小的寡核苷酸片段。通常將 DNase I 加入細(xì)胞裂解試劑中以去除由細(xì)菌細(xì)胞裂解物中 DNA 含量導(dǎo)致的粘性或去除由體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的 RNA 中的 DNA 模板。此等級的 DNase 足以進(jìn)行蛋白研究。在任何需要酶切 DNA 的應(yīng)用中使用無 RNase 的 DNase，其對于避免 RNA 損傷至關(guān)重要。

關(guān)于 DNase I 使用的一般信息：

•鈣離子對于 DNase I 的活性是必需的。痕量 Ca++ 可能以足夠高的濃度存在，使 DNase I 具有活性，但是使用 EGTA 或無鈣緩沖液可將 DNase I 的活性降低到無法檢測到的水平。

•高水平（即，100 mM）的單價(jià)離子（如 Na+ 和 K+）將降低 DNase I 活性

•通過加熱至 65°C 并維持10 分鐘使 DNase I 失活

•Kunitz 單位：1 Kunitz 單位為，在 25°C 條件（0.1M NaOAc，pH 值 5.0）下因降解高度聚合 DNA 使吸光度增加 0.001 A260nm/min/mL 所需的酶量

•降解分析單位：1 單位定義為在 37°C 條件下，在 10 mM Tris·HCl（pH 值 7.5）、50 mM MgCl2、13 mM CaCl2 中，10 分鐘內(nèi)將 1 μg 質(zhì)粒 DNA 降解所需的酶量。

規(guī)格：

• 數(shù)量：0.5 mL

•濃度：≥2500 單位/mL

• 單位定義：1 單位定義為在 25°C 下，高度聚合 DNA 使 260nm 處吸光度增加 0.001/min/mL 所需的酶量。

• 外觀：透明、無色液體，不含不溶性材料

•配方：DNase I，溶劑為 10 mM Tris-HCl（pH 值 7.5）、10 mM CaCl2、10 mM MgCl2

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