1. 細(xì)胞準(zhǔn)備

1.1

復(fù)蘇與培養(yǎng)

OvCar8、A2780、UF-403 用 DMEM+10 % FBS+1 % P/S；Detroit 551 與 UF-403 成纖維細(xì)胞用 DMEM+20 % FBS+1 % P/S+ITS+0.1 µM Dex,每 2–3 天換液，維持對數(shù)期

1.2

STR 鑒定 & 支原體檢測

通過 STR 16 位點(diǎn)確認(rèn)身份；MycoAlert 試劑盒，陰性方可進(jìn)入實(shí)驗(yàn)

1.3

熒光預(yù)標(biāo)記

癌細(xì)胞：CellTracker Deep Red（OvCar8 2 µM；A2780 5 µM；UF-403 1 µM，1 h）；成纖維細(xì)胞：CellTracker Green CMFDA（按說明書）

2. 細(xì)胞計(jì)數(shù)與混合

2.1

單細(xì)胞懸液制備

0.25 % Trypsin-EDTA 消化，中和后離心 300 × g 3 min

2.2

按比例混合

① OvCar8 : 成纖維 = 2 : 1；② A2780 : 成纖維 = 1 : 1；③ UF-403 : 成纖維 = 2 : 1；總細(xì)胞數(shù) 12 000/孔（OvCar8）、2 500/孔（A2780）

3. 球狀體形成

3.1

接種

96 孔超低附著板 (ULA, Corning 4520)；每孔 100 µL 混合懸液

3.2

離心促聚集

300 × g 3 min

3.3

培養(yǎng)

37 °C、5 % CO?，96 h；每日 4× 鏡檢記錄

4. 生長監(jiān)測

4.1

明場成像

0 h、24 h、48 h、72 h、96 h 時(shí)間點(diǎn)

4.2

計(jì)算生長動力學(xué)

軟件自動輸出面積 vs 時(shí)間曲線

5. 結(jié)構(gòu)表征

5.1

掃描電鏡 (SEM)

2.5 % 戊二醛固定 1 h → 1 % 鋨酸后固定 1.5 h → 梯度乙醇脫水 → HMDS 干燥 → 金濺射

5.2

激光共聚焦 (LSM)

4 % PFA 固定 1 h → 0.5 M 甘氨酸 → 0.2 % Triton + 20 % DMSO 透化 → Hoechst 33342 核染 → 88 % 甘油透明

5.3

免疫組化 (IHC)

瓊脂預(yù)包埋→ 石蠟切片 4 µm → Ki-67、PAX8、FAP 抗體 → Bond RX 自動染色

6. 功能實(shí)驗(yàn)

6.1

藥物處理

72 h 換 50 % 新鮮培養(yǎng)基 → 加入 100 µM 順鉑或 PBS；繼續(xù) 24 h

6.2

細(xì)胞毒性測定

CellTox Green（1 : 2 000）染色 24 h → NYONE 定量熒光

6.3

凋亡檢測

RealTime-Glo + Caspase-Glo 3/7 雙熒光素酶法

6.4

活/死染色

Calcein-AM (活細(xì)胞綠) + PI (死細(xì)胞紅) + Hoechst 33342

7. 順序接種（可選）

7.1

延遲 24 h 接種

① 先成纖維后癌；② 先癌后成纖維；其余步驟同 3.1–3.3

8. 數(shù)據(jù)與統(tǒng)計(jì)

8.1

圖像分析

NYONE、ZEN 3.5、Keyence 軟件分別處理明場、共聚焦、熒光

8.2

統(tǒng)計(jì)分析

GraphPad Prism 10.2.2；單因素 ANOVA + Dunnett 或 t-test